Рекомендации от компании БиолоТ для заказывающих услугу по наращиванию клеток.
Клетки поставляются во флаконах, заполненными под горло средой культивирования. После поступления клеток конечный пользователь, имеющий опыт культивирования этой клеточной линии, должен в этот же день оценить под микроскопом состояние клеточной линии, чтобы определить дальнейшую работу с клетками. Невозможно рекомендовать все возможные варианты работы с клетками после их транспортировки, и именно опыт заказавшего клетки сотрудника позволит определить дальнейшие действия. Тем не менее, основные рекомендации могут заключаться в следующем:
- в случае монослойных клеточных линий оценить уровень и примерный процент открепленных клеток. В случае даже значительного открепления клеток от подложки, можно рекомендовать оставить клетки на ночь в термостате; обычно клетки за ночь прикрепляются к подложке и могут быть далее рассеяны. В случае необходимости, клетки можно оставить в исходном флаконе в термостате и на более длительный срок до достижения монослоя. Даже при плотном монослое клетки не перерастут из-за избытка среды в заполненном доверху флаконе. После образования клеточного монослоя или решения сотрудника пересеять клетки перед открыванием флакона необходимо аккуратно снять защитную пленку с горлышка, перевернуть флакон вниз горлышком и опустить его в 96-процентный этиловый спирт, чтобы спирт попал во все полости под крышку флакона и простерилизовал внутреннее доступное для спирта пространство. После этого аккуратно открутить горлышко и либо стерильной пипеткой Пастера под вакуумом , либо смоченной в 96-процентном спирте ваткой осушить края горлышка флакона и внутреннюю поверхность крышки. Это важно для дальнейшей стерильной работы с этим флаконом. Среду из флакона перелить в стерильную емкость для дальнейшего использования. Сняв клетки диспергирующим раствором и рассеяв в нужной концентрации, залить флакон старой средой (4-5 мл на флакон 25 кв см) для наращивания клеток для последующей заморозки. Замораживание клеток рекомендуется делать только после того, как культура примет свойственную ей морфологию и восстановит ростовые характеристики. Замораживание клеток предпочтительно производить в среде с 90% сыворотки и 10% ДМСО (наиболее щадящий для клеток способ). Обычно с одного флакона площадью 25 кв см можно заморозить 3-4 ампулы клеток (рекомендованная концентрация клеток при замораживании 1-5 млн клеток/мл). После замораживания можно пробовать разморозить клетки на другие серии сред и сывороток, если в нашей компании не были закуплены среды и сыворотки для этой клеточной линии.
- при работе с суспензионными клеточными линиями открывать флакон аналогично рекомендациям выше. Далее нужно слить клетки в стерильную коническую центрифужную пробирку на 50 мл, центрифугировать 5 мин при 1500 об/мин, среду слить в отдельный стерильный флакон для дальнейшего использования. Встряхнуть клеточный осадок и рассеять клетки в нужной концентрации с использованием части слитой среды с сывороткой. Замораживание клеток проводить аналогично описанным выше рекомендациям.